對于在-80℃保存時間較久的甘油菌，有可能出現以下情況：（1）被雜菌污染；（2）目的菌質粒丟失；（3）目的菌活性變低。所以，需要通過平板劃線、篩選培養，重新獲得高活性的單個目的菌。

二、如何進行平板劃線？

1、三區平板劃線

將平板劃分為三個逐漸縮小的區域，接種環依次密集到稀疏劃線，并與前一區輕微搭接，通過逐級稀釋在第三區獲得單菌落，常用于臨床標本的首次分離，尤其適合菌量不高的樣品。

2、四區平板劃線

在三區基礎上增加一個區域，四個區域依次遞減、輕微搭接，稀釋效果更徹底，能進一步降低菌量密度，適合污染嚴重或菌量高的樣品，提高純培養的成功率。

3、單次連續之字劃線

接種環從平板一端到另一端連續劃“之”字，不交叉、不重復，使菌液沿全程均勻分布，適合菌量已知的純培養或增菌液接種；也可用于混合樣本分離，但稀釋梯度不如分區劃線明顯，獲得單菌落的概率相對較低。

4、網狀平板劃線

先做一次“之”字劃線，再將平板旋轉90°進行垂直劃線，形成交叉網格，增加劃線面積和稀釋機會，適合生長緩慢或菌落細小的微生物分離，但交叉處菌落可能過密。

三、三區平板劃線操作步驟

1、 左手拿培養皿，右手持接種環，打開蓋子一條縫隙，將沾菌接種環在平皿邊緣“之”字劃第一區域（約 1/4～1/5 面積）。

2、 轉動培養皿約 120°，灼燒冷卻接種環，從第一區末端帶菌在第二區劃線。

3、 再轉動培養皿約 120°，灼燒冷卻接種環，從第二區末端帶菌在第三區劃線。

?? 注意：各區劃線僅與前一區少量相交，絕不與其他區域重疊；全程應在超凈工作臺中進行。

四、常見問題及解決辦法

   原因：菌量過大或劃線過密，稀釋梯度不足。 

   解決：甘油菌先 10??～10?? 稀釋；第二、三區再稀疏些；必要時改用四區法。

2、平板無菌落 

   原因：菌已失活或接種量過少；抗性平板選錯抗生素；培養條件不符。 

   解決：換用新鮮甘油菌、降低抗生素濃度、檢查培養溫度/氣體條件。

3、雜菌覆蓋目的菌 

   原因：甘油菌污染或操作污染。 

   解決：重新劃線時加入目的菌特需抗性/顯色底物；操作前用75%酒精擦拭工作臺并紫外再照15 min；必要時用無菌濾紙貼蓋法二次純化。

4、 單菌落過少或分布不均 

   原因：接種環未充分冷卻殺死部分菌；旋轉角度不足導致稀釋梯度不足。 

   解決：灼燒后冷卻 5–10 s；確保每區旋轉≈120°；可在第三區尾端再輕劃兩條補充線。